Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
A previous sequence analysis of a US5 gene fragment of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) performed in an Argentinian epidemiological study allowed to differentiate between wild and vaccine strains. This analysis also defined five ILTV haplotypes with specific variations at positions 461, 484...
| Autores principales: | , , , , , |
|---|---|
| Formato: | Artículo |
| Lenguaje: | Inglés |
| Publicado: |
Elsevier
2020
|
| Materias: | |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/20.500.12123/7988 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S032575412030064X https://doi.org/10.1016/j.ram.2020.04.008 |
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|---|---|
| author | Rojas, María Florencia Konig, Guido Alberto Vagnozzi, Ariel Eduardo Vera, Federico Sebastian Scolaro, Luis Alberto Craig, María Isabel |
| author_browse | Craig, María Isabel Konig, Guido Alberto Rojas, María Florencia Scolaro, Luis Alberto Vagnozzi, Ariel Eduardo Vera, Federico Sebastian |
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| author_sort | Rojas, María Florencia |
| collection | INTA Digital |
| description | A previous sequence analysis of a US5 gene fragment of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) performed in an Argentinian epidemiological study allowed to differentiate between wild and vaccine strains. This analysis also defined five ILTV haplotypes with specific variations at positions 461, 484, 832, 878 and 894 of the US5 gene. This characterization of viral strains may also be accomplished using the High-Resolution Melting Analysis (HRMA), which has been described as an effective, fast and sensitive method to detect mutations in PCR products. In the present study, an HRM protocol was developed with the aim of characterizing the circulating ILTV strains in Argentina. The specificity of this tool was confirmed in different DNA diluents, without interference from heterologous DNA or other cellular metabolites. Additionally, the salt concentration in the elution buffer used for DNA extraction did not alter the curve profiles. Higher concentrations of DNA (Ct ≅ 26.0) displayed well-defined curve profiles, whereas lower concentrations (Ct ≅ 32.5) exhibited more heterogeneous curves. The HRMA showed 97.49% concordance with the reference technique, i.e., sequencing. The HRM protocol has the capability to perform DNA amplification prior to its characterization. Thus, eventually this technique may be used simultaneously as a diagnostic tool. This advantage implies a significant reduction in the time and effort involved in sample processing. |
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| id | INTA7988 |
| institution | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA -Argentina) |
| language | Inglés |
| publishDate | 2020 |
| publishDateRange | 2020 |
| publishDateSort | 2020 |
| publisher | Elsevier |
| publisherStr | Elsevier |
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| spelling | INTA79882020-09-29T14:34:07Z Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar Rojas, María Florencia Konig, Guido Alberto Vagnozzi, Ariel Eduardo Vera, Federico Sebastian Scolaro, Luis Alberto Craig, María Isabel Enfermedades de los Animales Laringotraqueitis Virus Bronquitis Infecciosa Aviar Genética Animal Diseases Laryngotracheitis Avian Infectious Bronchitis Virus Genetics Virus de la Laringotraqueítis Infecciosa Aviar Avian Infectious Laryngotracheitis Virus A previous sequence analysis of a US5 gene fragment of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) performed in an Argentinian epidemiological study allowed to differentiate between wild and vaccine strains. This analysis also defined five ILTV haplotypes with specific variations at positions 461, 484, 832, 878 and 894 of the US5 gene. This characterization of viral strains may also be accomplished using the High-Resolution Melting Analysis (HRMA), which has been described as an effective, fast and sensitive method to detect mutations in PCR products. In the present study, an HRM protocol was developed with the aim of characterizing the circulating ILTV strains in Argentina. The specificity of this tool was confirmed in different DNA diluents, without interference from heterologous DNA or other cellular metabolites. Additionally, the salt concentration in the elution buffer used for DNA extraction did not alter the curve profiles. Higher concentrations of DNA (Ct ≅ 26.0) displayed well-defined curve profiles, whereas lower concentrations (Ct ≅ 32.5) exhibited more heterogeneous curves. The HRMA showed 97.49% concordance with the reference technique, i.e., sequencing. The HRM protocol has the capability to perform DNA amplification prior to its characterization. Thus, eventually this technique may be used simultaneously as a diagnostic tool. This advantage implies a significant reduction in the time and effort involved in sample processing. En un estudio epidemiológico realizado previamente en Argentina, se analizó la secuencia de un fragmento del gen US5 del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), lo que permitió diferenciar las cepas de campo de las vacunales. También esto permitió definir cinco haplotipos del ILTV, con variaciones específicas en las posiciones 461, 484, 832, 878 y 894 del gen US5. La caracterización de las cepas virales también puede lograrse mediante el análisis de la disociación de alta resolución o high-resolution melting analysis (HRMA), descripto como un método efectivo, rápido y sensible para detectar mutaciones en productos de PCR. En el presente estudio se desarrolló un protocolo de disociación de alta resolución con el objetivo de caracterizar cepas del ILTV circulantes en Argentina. Para ello,se confirmó la especificidad de esta herramienta en diferentes diluyentes del ADN de las muestras, sin observarse interferencias en presencia de ADN heterólogo u otros metabolitos celulares. Asimismo, la concentración de sales en el buffer de elución utilizado durante la extracción de ADN no alteró los perfiles de las curvas. Se obtuvieron perfiles bien definidos con concentraciones de ADN más elevadas (Ct ≅ 26.0), mientras que concentraciones más bajas presentaron curvas heterogéneas (Ct ≅ 32.5). El HRMA mostró una concordancia del 97.49% con la técnica de referencia, la secuenciación. El protocolo de disociación de alta resolución amplifica el ADN antes de su caracterización, por lo que esta técnica podría ser eventualmente utilizada para confirmar la presencia del ILTV y, al mismo tiempo, distinguir haplotipos, optimizando su valor como herramienta de diagnóstico. Esta característica implica una reducción significativa en el tiempo dedicado al procesamiento de muestras. EEA Concepción del Uruguay Fil: Rojas, María Florencia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay. Laboratorio de Sanidad Aviar; Argentina Fil: Konig, Guido Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Vagnozzi, Ariel Eduardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina Fil: Vera, Federico Sebastian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay. Laboratorio Sanidad Aviar; Argentina Fil: Scolaro, Luis Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina Fil: Craig, María Isabel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina 2020-09-29T14:26:53Z 2020-09-29T14:26:53Z 2020-09 info:ar-repo/semantics/artículo info:eu-repo/semantics/article info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://hdl.handle.net/20.500.12123/7988 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S032575412030064X 0325-7541 1851-7617 https://doi.org/10.1016/j.ram.2020.04.008 eng info:eu-repo/semantics/openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) application/pdf Elsevier Revista Argentina de Microbiología (Available online 10 September 2020) |
| spellingShingle | Enfermedades de los Animales Laringotraqueitis Virus Bronquitis Infecciosa Aviar Genética Animal Diseases Laryngotracheitis Avian Infectious Bronchitis Virus Genetics Virus de la Laringotraqueítis Infecciosa Aviar Avian Infectious Laryngotracheitis Virus Rojas, María Florencia Konig, Guido Alberto Vagnozzi, Ariel Eduardo Vera, Federico Sebastian Scolaro, Luis Alberto Craig, María Isabel Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus = Optimización y aplicación de un protocolo de desnaturalización de alta resolución en la caracterización del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar |
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